表皮干细胞表面标志物及向皮肤分化：理论特色与应用的可行性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.28.024

摘要/Abstract

摘要：

背景：表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞，不仅是维持皮肤新陈代谢的主要功能细胞，而且与创面修复紧密相关，是皮肤及其附属器发生、修复的基础。现在表皮干细胞凭借其特有的生物学优势在基因治疗、细胞治疗中越来越受到重视。
目的：对表皮干细胞的特性及临床应用研究现状进行综述。
方法：应用计算机检索 CNKI、 PubMed 数据库以及进行Google学术搜索，检索词为“表皮干细胞，临床应用，干细胞分裂；干细胞培养；epidermal stem cells，stem cells division，stem cells culture，clinical application”。排除较陈旧的理论观点以及重复性研究，最后纳入41篇文献。
结果与结论：表皮干细胞作为皮肤组织的特异性干细胞，是维持皮肤新陈代谢的主要功能细胞和皮肤及其附属器发生、修复、改建的基础。表皮干细胞研究已显示出巨大的临床应用前景，对烧伤、创伤等大面积皮肤缺损的治疗以及组织工程皮肤、基因治疗等方面都有重大意义。目前在表皮干细胞研究领域里仍有很多问题需解决，例如如何筛选公认的具有表皮干细胞特异性的表面标志物，如何诱导表皮干细胞朝着特定的皮肤结构进行分化等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 培养, 表皮干细胞, 组织工程皮肤, 基因治疗, 临床应用

Abstract:

BACKGROUND: Epidermal stem cells as special stem cells of the skin not only plays an important role in maintaining the metabolism of skin, but also is closely related to wound repair, which are the basis for the occurrence and repair of skin and its appendages. Now, epidermal stem cells have been paid great attention on the research of gene therapy and cell therapy with its specific biological advantages.
OBJECTIVE: To summarize the research status on features and clinical application of epidermal stem cells.
METHODS: A computer-based online retrieval of CNKI, PubMed database and Google scholar was performed for searching papers about clinical application of epidermal stem cells using the keywords of “epidermal stem cells, stem cells division, stem cells culture, clinical application” in Chinese and English. Older theoretical perspectives and repetitive research were excluded. Finally, only 41 articles were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Epidermal stem cells have the great potential of proliferation and multi-directional differentiation, and have important significances for large-area skin defects (burn and trauma), skin tissue engineering, and gene therapy. There are still many problems that need to be solved, such as how to screen surface markers special for epidermal stem cells and how to induce skin differentiation of epidermal stem cells.

全文链接：

Key words: epidermis, stem cells, cell division, cells, cultured, review

中图分类号:

R318

刘光荣，陈清元，胡冠松，蔡玉春.. 表皮干细胞表面标志物及向皮肤分化：理论特色与应用的可行性[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(28): 4573-4577.

Liu Guang-rong, Chen Qing-yuan, Hu Guan-song, Cai Yu-chun. Surface markers and skin differentiation of epidermal stem cells: theoretical features and clinical feasibility[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(28): 4573-4577.

图/表（结果） 1

2.1 表皮干细胞的来源与分布在形态学上表现为细胞呈球形、致密、体积小、核质比高、胞内RNA含量低和细胞器少等特征。表皮细胞存在3种状态：干细胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞。表皮干细胞先分化为一种具有限分裂循环过渡性扩充细胞或短暂扩充细胞，属定向祖细胞，再经过几次到十几次不等的分裂，分化为有丝分裂后细胞及终末分化细胞。表皮干细胞大致有5种来源^[1]：①胚胎干细胞诱导分化产生。②已分化细胞逆转产生。③间充质细胞再生为表皮干细胞。④毛囊处的干细胞分化产生。⑤造血干细胞或其他组织干细胞随血液循环迁移或过客至皮肤组织。另外，研究发现表达Lgr6基因的干细胞可能是最原始的表皮干细胞，能发育成皮肤中各种细胞，被誉为是“皮肤干细胞之母”^[2]。

哺乳动物表皮中包含有多种不同类型的表皮干细胞，它们主要位于表皮基底层及毛囊部，这些干细胞包括毛囊间表皮干细胞、毛囊干细胞、皮脂腺前体干细胞以及毛囊峡部干细胞^[3]，其中毛囊干细胞位于毛囊隆突部位，毛囊间表皮干细胞位于表皮基底层，皮脂腺干细胞独立于毛囊干细胞而存在，在维持皮脂腺组织稳态过程中发挥作用；毛囊峡部干细胞位于毛囊隆突部和皮脂腺之间，但峡部细胞是否为独立存在的干细胞，还需要进一步证明^[4]。

表皮干细胞为组织特异性干细胞，根据人体年龄不同和人体位置不同，表皮干细胞的分布和比例也不同。表皮干细胞在皮肤组织中的分布也有其特定的空间布局模式，利用LacZ反转录病毒感染小鼠和人的角质细胞，发现表皮的确有表皮增殖单位(epidermal proliferative unite，EPU)的存在^[5]。每单位由居于基底层中心的一个表皮干细胞、基底层上层的大约10个短暂扩充细胞及最上层的多个定向细胞组成，呈六角形。2004年，牛云飞等^[6]通过检测皮肤中角蛋白19和整合素β1的表达，发现头皮的毛囊隆突部及包皮和阴囊的皮肤基底层存在较多表皮干细胞，背部及四肢近端外侧皮肤基底层存在的表皮干细胞多于胸部及四肢近端内侧。2006年，陈晓东等^[7]利用P63转录因子和CD29(整合素β1)检测正常人头顶部、足背、足底、阴阜(阴毛区)、阴囊等21个部位的皮肤组织表皮干细胞的分布规律，发现人头顶部、阴阜、阴囊皮肤组织中的表皮干细胞多于其他部位。2012 年，Dahl等^[8]发现，成人表皮干细胞主要位于表皮细胞龛、皮脂腺和毛囊的隆突区域，这些表皮干细胞能够发育成表皮的各种细胞，更新死亡的表皮、皮脂腺和毛囊。

2.2 表皮干细胞的分裂表皮干细胞具有双向分化的能力，一方面可向下迁移分化为表皮基底层，进而生成毛囊；另一方面可向上迁移并最终分化为各种表皮细胞。正常情况下，表皮干细胞分裂缓慢，分裂方式是不对称分裂，即一个干细胞分裂成一个干细胞和一个定向祖细胞；但在皮肤损伤等情况下，表皮干细胞快速分裂，干细胞增殖方式改变为对称分裂，按一定概率分裂成干细胞或定向祖细胞，即一个干细胞分裂为两个干细胞或两个定向祖细胞^[9]。此外，表皮干细胞通常处于静息状态，干细胞具有周期节律(休眠-激活)，周期被扰乱会导致干细胞的异质化，出现表皮过早老化或者可能导致癌症的发生^[10]。

表皮干细胞的增殖与分化主要受内源性和外源性因素的双重调控，调控失调容易导致皮肤癌^[11]。内源性因素主要有MAPK信号通路、Notch信号转导通路、Wnt信号通路、C-Myc、细胞因子、端粒酶和p63转录因子等。外源性因素主要是表皮干细胞的“壁龛”^[12]，也就是其生存的微环境，它通过细胞与细胞、细胞与细胞外基质等调控着干细胞的增殖和分化。例如，Connelly等^[13]发现微环境中肌动蛋白和血清就影响着表皮干细胞的表达；Wong等^[14]发现“壁龛”诱导表皮干细胞启动修复能力；Bonfanti等^[15]发现“壁龛”能将胸腺上皮细胞转化成皮肤干细胞；Zeng等^[16]发现表皮生长因子在伤口愈合中扮演重要角色，表达失调可能导致癌症的发生。当干细胞微环境发生改变，胞外的信息可通过整合素传递给干细胞，以触发跨膜信号转导调控细胞的基因表达。这一过程不仅可以改变干细胞的分裂方式，尚可激活干细胞的多潜能性，使干细胞产生一种或多种定向祖细胞以适应机体的需要。

2.3 表皮干细胞的鉴别和分离培养表皮干细胞具有3个典型特征是：①慢周期性。在新生动物细胞分裂活跃时掺入氚标记的胸苷或尿苷，由于干细胞分裂缓慢，故可长期探测到放射活性干细胞的自我更新能力。②较强的自我更新能力。在体外培养干细胞则表现为无限的增殖能力，形成细胞克隆，从而识别离体的干细胞。③对皮肤基底膜的黏附性。利用干细胞的慢周期性及自我更新能力来鉴定体内与体外干细胞是最基本的实验手段。但这两种鉴别干细胞的方法花费时间长，应用不方便。目前主要利用表皮干细胞的特异性标记物-β1整合素、α6整合素、K19、K15、P63、CD200、烟酸己可碱、e-钙粘连蛋白、β，γ-连环蛋白等来鉴别表皮干细胞^[17-19]。

常用于分离表皮干细胞的方法大致有3种，即克隆筛选法、流式细胞术和快速黏附法。①克隆筛选法：表皮干细胞离体培养时呈克隆性生长，可连续传代培养，通过对克隆形成能力的分析可进行表皮干细胞的体外鉴别及分离。该法操作繁杂但准确性较高。②流式细胞术：利用相应的单克隆抗体对表面干细胞的特异性标记物进行标记，并通过流式细胞仪进行分选。但该法因为没有公认的表面标记物，无法有效的分离出高纯度的表皮干细胞，且分选后细胞活性受到一定的影响。③快速黏附法：表皮干细胞对Ⅳ型胶原、纤维黏连素和层黏连素的黏附速度比其他细胞快，将分离得到的表皮干细胞置于Ⅳ型胶原培养基不断传代、克隆，可实现对表皮干细胞的分离。这种方法简单易行，获得的干细胞生长良好，但对表皮干细胞的分选精度较低。此外也有通过新型的磁性活化细胞分选法(MACS)，可以快速分离表皮干细胞，但是否能广泛应用还需继续研究^[20]。

表皮细胞培养可分为体内和体外培养。体内培养又称原位培养，即将获得的表皮细胞种植于载体，再连同载体移植于创面，使细胞继续生长并达到封闭创面的目的。体外培养技术主要包括组织块培养法、滋养层培养法、无血清培养法和气液界面培养法等。体外培养受到许多因素的影响，主要的影响因素有分离培养组织和胶原的选择、条件培养基和表皮生长因子等^[21]。

近年，美国NASA准许旋转式生物反应器就属于体外培养，它模拟微重力条件，可以支持人表皮干细胞分裂，相比于静态培养条件更易形成多种表皮结构^[22]。这种生物反应器通过旋转可以克服某些静态培养干细胞时出现的沉淀问题，创造出悬液培养环境，加强细胞间作用，有可能成为理想的3D表皮组织培养方法。

端粒酶活性的丧失及其增殖相关基因表达的改变可能是造成表皮干细胞体内动员紊乱和体外克隆活动缺陷的主要原因^[23]。

2.4 表皮干细胞的临床应用创伤修复皮肤创伤愈合主要包括炎症反应、组织修复和瘢痕形成塑形期等3个阶段^[24]，这3个阶段之间既有区别，又相互交叉覆盖，构成了一个复杂而连续的生物反应过程。

炎症反应阶段：表皮干细胞的参与方式尚不明确。一般的观点认为人类真皮有一种肥大细胞祖细胞，在皮肤创伤时，这些肥大细胞前体细胞与皮肤内其他造血祖细胞通过诱导分化巨噬细胞、树突状细胞等其他炎症细胞，共同参与创伤愈合初期的炎症反应阶段^[25]。

组织修复阶段：如果皮肤基底层是完整的，基底细胞层内的表皮干细胞以自下而上分化增殖的方式进行修复。若是基底层受到破坏，则由伤口边缘附属器内的表皮干细胞向伤口分化、增殖、迁移而进行修复。若损伤较深，毛囊大部分结构被破坏，伤口愈合过程就会变慢。

瘢痕形成塑性期：表皮干细胞通过复杂通路作用于成纤维细胞，调控其在瘢痕形成过程中的活动，减少瘢痕的形成^[26]，上皮化时间超过3周，就会发生增生性瘢痕或者瘢痕疙瘩。皮肤中上皮生长因子可以促进伤口原位的表皮干细胞生长、加速上皮化过程减少瘢痕形成。

2.4.1 组织工程皮肤组织工程皮肤包括种子细胞和支架，其中种子细胞的选择非常重要^[27-28]。根据组成不同分为组织工程化表皮、组织工程化真皮和组织工程化复合皮。

组织工程化表皮：通过少量种子细胞的体外扩增后形成表皮细胞膜片，可作为表皮替代物。然而，表皮膜片还存在很多不足^[29]：一是缺少特殊皮肤附属器，对于出汗有影响；二是缺少真皮层，只能通过血液的渗透营养表皮，成活后稳定性差且缺乏弹性和韧性，易出现水疱和破溃并可能导致瘢痕的产生。三是表皮膜片的体外培养周期长(二三周)，成活率较低(平均50%)，膜片薄而脆。

组织工程化真皮：随表皮替代物的研究发展，针对单纯真皮替代物的研究并不多。真皮层的存在能增加愈后皮肤弹性，柔韧性会防止伤口紧缩，能减少瘢痕的产生，并提供更大的机械稳定性。根据真皮替代物使用材料的不同可分为天然材料真皮替代物和合成材料真皮替代物等。

组织工程化复合皮：理想的皮肤替代物应为复合皮肤替代物。这种复合皮肤既具有表皮层又具有真皮层，表皮层可以快速地获得充分的屏障和保护功能，与伤口创面充分一体化，真皮层可以快速进行血管化和神经再分布，可快速促进生理性伤口修复。真皮血管化是组织工程皮肤移植成功的重要一步^[30-31]。

2.4.2 基因治疗因为表皮干细胞终身存在，且能将遗传信息传给子细胞，所以干细胞不仅可以研究某些疾病的基因机制，而且可以对这些疾病进行基因治疗。基因治疗过程中，获得高效率转染、持久高水平的基因表达是治疗成功的关键。但是外源性基因导入进行基因治疗，目的基因很快消失。对于这种现象的产生目前有两种解释^[32]：一种观点认为这种基因表达的损失与病毒启动因子的失活有关；另一种观点则认为是干细胞基因转染失败，因为真正的表皮干细胞在表皮组织中所占的比例不到10%，且多处于G₀期，而细胞能进行分裂是反转录病毒整合的必须条件。因此当伤口被病毒感染时，很难使外源性基因成功导入。然而，Kuhn等^[33]发现病毒载体能将靶基因转入静止期的细胞中，这对目的基因的导入提供新的研究方向。

在皮肤肿瘤治疗方面，可以通过导入肿瘤抑制基因，阻断和抑制肿瘤的发生，还可将耐药基因或造血生长因子导入细胞中，提高其化疗耐受力。

2.4.3 其他表皮干细胞在美容整形手术中也有重要应用，“干细胞原位培植四维抗衰老美容整形手术”，在对衰老组织的三维整形过程中，结合时间因素和研究对象的具体特点，临床上可最大限度地满足衰老皮肤的美容整形。Luis等^[34]发现CbX4蛋白能够阻止表皮干细胞的增殖、分化和衰老，促进干细胞的静默，而这可能是抗衰老的另一种途径。Gannon等^[35]发现Mdm2基因可以调节表皮干细胞中p53的含量高低，p53表达过度，小鼠衰老加剧，出现表皮变薄，伤口愈合缓慢，皮毛减少等情况。

Huang等^[36]探究以脐带内层细胞作为表皮干细胞来源，应用于临床表皮修复的可能性。周晓秋等^[37]发现毛囊干细胞标记物CK15是毛分化、皮脂腺分化皮肤附属器肿瘤的特异性标记物，干细胞标记物 Nestin 在这些肿瘤的表达方式可以作为肿瘤成分分化特点的参考。孟繁剑等^[38]通过实时 RT-PCR方法发现经定向诱导分化后表皮干细胞可表达与正常结膜上皮细胞相类似的分子生物学特征，为探究人工合成结膜奠定一定基础。毛囊多潜能干细胞在体外培养过程中能分化成为神经元、神经胶质细胞、角质细胞、平滑肌细胞和黑色素细胞，并且能够促进外周神经和脊髓损伤修复^[39-40]。有作者通过小鼠实验发现表皮干细胞以及皮肤的稳定本质在于转录因子E4F1，这样为皮肤的损伤修复、组织工程皮肤都具有重要的促进作用^[41]。

参考文献

[1]谢一帆,吴岩.表皮干细胞的研究进展[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(19): 3578-3580.
[2]Snippert HJ, Haegebarth A, Kasper M,et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.Science. 2010;327(5971):1385-1389.
[3]吕玲玲,李发成.表皮干细胞在创伤愈合中的作用[J].组织工程与重建外科杂志,2013,9(3): 171-172.
[4]王丽娟,王友亮,杨晓.表皮干细胞研究进展[J].遗传,2010,32(3): 198-204.
[5]Ghazizadeh S, Taichman LB. Multiple classes of stem cells in cutaneous epithelium: a lineage analysis of adult mouse skin. EMBO J. 2001;20(6):1215-1222.
[6]牛云飞,路卫,夏照帆.表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布差异[J].第二军医大学学报,2004,25(9): 959-961.
[7]陈晓东,利天增,祁少海.正常人不同部位皮肤表皮干细胞分布规律的研究[J].中华烧伤杂志,2006,22(1): 53-56.
[8]Dahl MV.Stem cells and the skin.J Cosmet Dermatol. 2012; 11(4):297-306.
[9]Li X, Upadhyay AK, Bullock AJ,et al. Skin stem cell hypotheses and long term clone survival--explored using agent-based modelling.Sci Rep. 2013;3:1904.
[10]Janich P, Pascual G, Merlos-Suárez A,et al. The circadian molecular clock creates epidermal stem cell heterogeneity. Nature. 2011;480(7376):209-214.
[11]Box NF, Torchia EC, Roop DR.Are stem cell niches shared for skin cancers?Pigment Cell Melanoma Res. 2010;23(4): 517-520.
[12]Scadden DT. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 2006;441(7097):1075-1079.
[13]Connelly JT, Gautrot JE, Trappmann B,et al. Actin and serum response factor transduce physical cues from the microenvironment to regulate epidermal stem cell fate decisions.Nat Cell Biol. 2010;12(7):711-718.
[14]Wong VW, Levi B, Rajadas J,et al. Stem cell niches for skin regeneration. Int J Biomater. 2012;2012:926059.
[15]Bilousova G, Roop DR. Altering cell fate: from thymus epithelium to skin stem cells. Cell Stem Cell. 2010;7(4): 419-420.
[16]Zeng F, Harris RC. Epidermal growth factor, from gene organization to bedside.Semin Cell Dev Biol. 2014;28C:2-11.
[17]郝飞,张玲,吴岩.表皮干细胞的生物学标记物[J].中国组织工程研究,2013,17(36): 6527-6532.
[18]Troy TC, Arabzadeh A, Turksen K. Re-assessing K15 as an epidermal stem cell marker. Stem Cell Rev. 2011;7(4): 927-934.
[19]Jiang S, Zhao L, Purandare B,et al. Differential expression of stem cell markers in human follicular bulge and interfollicular epidermal compartments.Histochem Cell Biol. 2010;133(4): 455-465.
[20]Chen W, Zhang WW, Shi C,et al. Enrichment of epidermal stem cells of rats by Vario magnetic activated cell sorting system.In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2013;49(8):583-588.
[21]田亚宁,周智辉,梁漫.表皮干细胞培养及中药诱导分化研究进展[J].世界中西医结合杂志,2013, 8(1): 97-99.
[22]Lei XH, Ning LN, Cao YJ,et al. NASA-approved rotary bioreactor enhances proliferation of human epidermal stem cells and supports formation of 3D epidermis-like structure. PLoS One. 2011;6(11):e26603.
[23]Flores I, Blasco MA. A p53-dependent response limits epidermal stem cell functionality and organismal size in mice with short telomeres. PLoS One. 2009;4(3):e4934.
[24]何强,邵军师,牛淑亮.创伤修复的分子生物学研究进展[J].科技视界,2013,(29): 126-127.
[25]Ohyama M, Okano H. Promise of human induced pluripotent stem cells in skin regeneration and investigation. J Invest Dermatol. 2014;134(3):605-609.
[26]Wang X, Liu Y, Deng Z,et al. Inhibition of dermal fibrosis in self-assembled skin equivalents by undifferentiated keratinocytes.J Dermatol Sci. 2009;53(2):103-111.
[27]Han YF, Tao R, Sun TJ,et al. Advances and opportunities for stem cell research in skin tissue engineering.Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012;16(13):1873-1877.
[28]Picardo NE, Khan WS.Tissue engineering applications and stem cell approaches to the skin, nerves and blood vessels.Curr Stem Cell Res Ther. 2012;7(2):115-121.
[29]MacNeil S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 2007;445(7130):874-880.
[30]田宝祥,樊华,刘凤彬.组织工程皮肤的生物学特性及其临床应用评价[J].中国组织工程研究与临床康复,2010, 14(2): 337-340.
[31]韩小强.组织工程化皮肤的血管构建[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(37): 7354-7357.
[32]高艳红,裴雪涛.皮肤干细胞的研究现状与应用前景[J].中华烧伤杂志,2003, 19(1): 60-62.
[33]Kuhn U, Terunuma A, Pfutzner W, et al. In vivo assessment of gene delivery to keratinocytes by lentiviral vectors.J Virol. 2002;76(3):1496-1504.
[34]Luis NM, Morey L, Mejetta S,et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 2011;9(3):233-246.
[35]Gannon HS, Donehower LA, Lyle S,et al. Mdm2-p53 signaling regulates epidermal stem cell senescence and premature aging phenotypes in mouse skin.Dev Biol. 2011;353(1):1-9.
[36]Huang L, Wong YP, Gu H, et al. Stem cell-like properties of human umbilical cord lining epithelial cells and the potential for epidermal reconstitution.Cytotherapy. 2011;13(2):145-155.
[37]周晓秋,孙莉,高虹,等.干细胞标记物CK15和Nestin在皮肤附属器肿瘤诊断中的意义[J].中华临床医师杂志:电子版,2013, 7(12): 5637-5641.
[38]孟繁剑,陈家祺.表皮干细胞分化结膜上皮细胞基因检测的实验研究[J].中国现代医生, 2011, 49(27): 10-12.
[39]Amoh Y, Kanoh M, Niiyama S,et al. Human hair follicle pluripotent stem (hfPS) cells promote regeneration of peripheral-nerve injury: an advantageous alternative to ES and iPS cells.J Cell Biochem. 2009;107(5):1016-1020.
[40]Amoh Y, Hoffman RM. Isolation and culture of hair follicle pluripotent stem (hfPS) cells and their use for nerve and spinal cord regeneration. Methods Mol Biol. 2010;585: 401-420.
[41]Kaur P, Potten CS.The interfollicular epidermal stem cell saga: sensationalism versus reality check.Exp Dermatol. 2011;20(9): 697-702.